一、原理
凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
⒈凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用SephadexG-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。
(资料图片仅供参考)
⒉柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。
⒊凝胶柱的制备凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。
凝胶的装填：将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加到层析的流速，千万不能超过最终流速。平衡凝胶床过夜，使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，或加一些有色物质来观察色带的移动，如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好，色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。
⒋加样和洗脱凝胶床经过平衡后，在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和，再用滴管加入样品。一般样品体积不大于凝胶总床体积的5%-10%。样品浓度与分配系数无关，故样品浓度可以提高，但分子量较大的物质，溶液的粘度将随浓度增加而增大，使分子运动受限，故样品与洗脱液的相对粘度不得超过1.5-2.样品加入后打开流出口，使样品渗入凝胶床内，当样品液面恰与凝胶床表面相平时，再加入数毫升洗脱液中洗管壁，使其全部进入凝胶床后，将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连，预先设计好流速，然后分部收集洗脱液，并对每一馏份做定性、定量测定。
⒌凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入0.02%的叠氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。
二、材料和耗材
1.器材：层析柱、恒流泵、自动部分收集器、紫外检测器、记录仪、量筒、烧杯、试管、吸管、玻璃棒等。
2.试剂
（1）牛血清
（2）洗脱液：0.9% NaCl溶液
三、实验步骤
1. 凝胶的前处理（如果是湿胶，此步略过）
将Sephadex G-75置烧杯中，加入洗脱液于室温溶胀2～3天，反复倾泻去掉细颗粒，然后减压抽气去除凝胶孔隙中的空气，沸水浴中煮沸2～3小时（可去除颗粒内部的空气及灭菌）。在凝胶溶胀时避免剧烈搅拌，以防凝胶交联结构的破坏。
2. 装柱
取洁净的的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。在柱中注入洗脱液（约1/3柱床高度），将凝胶浓浆液（1:1稀释）缓慢倾入柱中，待凝胶沉积约1～2cm 高度后打开出水口，使凝胶沉降，并不断加入凝胶浓浆。注意装柱过程中注意凝胶不能分层。
3. 平衡
装柱完成后，接上恒流泵，以0.9%的氯化钠为流动相，以0.75ml/min(Φ1.6cm柱)或0.5ml/min(Φ1.0cm柱)的速度开始洗脱，用5倍床体积的洗脱液平衡，使柱床稳定。在出口处测定流速以便后续准确确定收集体积。
4. 凝胶柱总体积（Vt）的测定。
平衡完毕后，测定凝胶柱床的高度，计算柱床总体积Vt（凝胶柱直径为1 cm或1.6cm）。
5. V0的测定（此步可略过）
打开出水口，使残余液体降至与胶面相切（但不要干胶），关闭出水口。用细滴管吸取0.2ml（4mg/ml）蓝色葡聚糖-2000，小心地绕柱壁一圈（距胶面2mm）缓慢加入，打开出水口（开始收集！），等溶液渗入胶床后，关闭出水口，用少许洗脱液冲洗2次，待渗入胶床后，再在柱上端加满洗脱液，开始洗脱，作出洗脱曲线。收集并量出从加样开始至洗脱液中蓝色葡聚糖浓度最高点（肉眼观察）的洗脱液体积即为V0。
蓝色葡聚糖洗下来之后，还要用洗脱液继续平衡１～２倍床体积（实验中平衡1hr），以备下步实验使用。
6. 上样、洗脱
将柱中多余的液体放出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口。用移液管吸取0.5mL（柱床体积约25 mL）蛋白质混合液小心地加到凝胶床上，打开出水口，待样品完全进入凝胶后，加少量洗脱液冲洗柱内壁2次，待液体完全流进床内后，关闭出水口。在柱上端加满洗脱液，打开恒流泵，开始洗脱收集，4~6 min一管（约3 mL）。用紫外分光光度计监测各管收集液的OD280值，软件以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘出洗脱曲线。在色谱峰对应的收集管上做好标记，用于SDS-PAGE。
7. 凝胶柱的后处理（由于放置时间过久将失效，可不做回收处理）
一般凝胶柱用过后，反复用蒸馏水（2～3倍床体积）通过柱即可。如若凝胶有颜色或比较脏，需用0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl洗涤，再用蒸馏水洗。冬季一般放2个月无长霉情况，但在夏季如果不用，需要加0.02%的叠氮化钠防腐。
8. 蛋白浓度测定
四、结果
五、思考题
1. 利用凝胶层析法分离混合样品时，怎样才能得到较好的分离效果？
1.装柱时要注意凝胶的流速，不宜过快，同时要保证凝胶能充分的沉淀且分布的比较均匀。2.凝胶溶胀所用的溶液应与洗脱用的溶液相同，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发生变化而影响分离效果。3.样品的浓度和加样量的多少。是影响分离效果的重要因素。样品浓度应适当大，但大分子物质的浓度大时，溶液的黏度也随之变大，会影响分离效果，要兼顾浓度与黏度两方面。加样量和加样体积越少分离效果越好，加样量一般为柱床体积的1%-2%，制备用量一般为柱床体积的20%-30%。
